Encabezado de página: RESPUESTA HUMORAL Y METODOLOGÍA DE NEUTRALIZACIÓN VIRAL EN VACUNACIÓN ANTIRRÁBICA — ZOOVET SERIE TÉCNICA VOL. II

1. Introducción

La vacunación antirrábica de los animales de compañía constituye la barrera biosanitaria primaria contra la introducción del virus de la rabia (RABV) en territorios libres de la enfermedad a través del movimiento internacional de mascotas. Para que esta vacunación cumpla su función regulatoria — permitir la certificación legal válida así como la identificación del animal (microchip) bajo marcos como el Reglamento (UE) n.° 576/2013, las disposiciones CDC/USDA vigentes desde agosto de 2024, y los instrumentos equivalentes del Reino Unido, Australia y Japón — la respuesta inmune que genera debe ser verificable mediante un método de laboratorio objetivo, reproducible e internacionalmente estandarizado.

Ese método es la prueba de neutralización viral sérica (VNT), operacionalizada en dos formas principales: la Prueba de Inhibición de Focos Fluorescentes Rápida (RFFIT, por sus siglas en inglés) y la Prueba de Neutralización Viral por Anticuerpos Fluorescentes (FAVN, por sus siglas en inglés). Ambas miden la capacidad funcional de los anticuerpos séricos para inhibir la infección de cultivos celulares por RABV in vitro, y ambas reportan resultados en Unidades Internacionales por mililitro (UI/mL) estandarizadas frente a un suero de referencia de la OMS. El umbral de ≥ 0,5 UI/mL, adoptado universalmente por la WOAH, la OMS y los principales marcos nacionales de importación, es el criterio de decisión regulatorio que determina si el resultado serológico de un animal se considera adecuado para el movimiento internacional.

La presente revisión descriptiva es la segunda de la Zoovet Travel Serie Técnica. Donde el Volumen I abordó el fundamento regulatorio e inmunológico del intervalo de 30 días post-primovacunación antes de la toma de muestra serológica, este documento se centra en la secuencia inmunológica subyacente que produce los anticuerpos que estas pruebas miden, los principios metodológicos de los ensayos, y las fuentes documentadas de variabilidad que el médico veterinario debe comprender para interpretar correctamente los resultados y anticipar posibles escenarios de fallo.

2. Respuesta Inmune Humoral Tras la Primovacunación Antirrábica

2.1. Activación Inmune Primaria: Del Antígeno al Linfocito

Las vacunas antirrábicas veterinarias comercialmente disponibles son, con contadas excepciones, preparaciones de virus inactivado o subunitarias formuladas con adyuvante (WOAH, 2024; Tizard, 2021). Tras la administración intramuscular o subcutánea, el antígeno vacunal — principalmente la glicoproteína G del RABV, que porta los epítopos de neutralización dominantes — es captado por células presentadoras de antígeno (CPA) profesionales, principalmente células dendríticas y macrófagos, en el sitio de inyección y en los ganglios linfáticos regionales (Flamand et al., 1993; Day, 2007).

El antígeno procesado es presentado a los linfocitos T CD4+ helper naive a través de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (MHC-II). Esta interacción, que requiere señales coestimuladoras, inicia la expansión clonal de linfocitos T helper antígeno-específicos. Simultáneamente, el antígeno de RABV puede activar directamente linfocitos B específicos a través del receptor de células B. La interacción T helper–célula B en los centros germinales de los órganos linfoides secundarios inicia la respuesta de anticuerpos primaria (Day, 2007; Tizard, 2021).

La literatura describe de forma consistente esta fase inicial — desde la administración del antígeno hasta el primer anticuerpo sérico detectable — como una fase lag durante la cual ocurre el procesamiento inmunológico pero aún no se detecta anticuerpo circulante a nivel del umbral ≥ 0,5 UI/mL en la mayoría de los animales. La duración de esta fase no es fija: está influenciada por el tipo de adyuvante, la dosis de antígeno, la vía de administración y la competencia inmunológica del huésped (Day, 2007; Kennedy et al., 2007).

2.2. Producción de IgM, Cambio de Clase y Consolidación de IgG

El primer isotipo de anticuerpo producido en la respuesta inmune primaria es la IgM, una molécula pentamérica con capacidad eficiente de aglutinación viral pero con afinidad relativamente menor en comparación con los isotipos IgG producidos posteriormente (Tizard, 2021). Los anticuerpos IgM son detectables más tempranamente en la respuesta y contribuyen a la neutralización viral inicial. Las VNT utilizadas en la certificación regulatoria (RFFIT y FAVN) detectan anticuerpos neutralizantes independientemente de su isotipo; sin embargo, las respuestas dominadas por IgM pueden producir títulos inferiores al umbral regulatorio en animales que posteriormente generarán una robusta respuesta IgG.

A medida que madura la respuesta primaria, los linfocitos B activados en los centros germinales sufren la recombinación por cambio de clase — un proceso molecular mediante el cual el gen de la región constante del anticuerpo es reemplazado, desplazando la producción de IgM a IgG (y en algunas líneas de células B, IgA o IgE). Simultáneamente, la maduración de afinidad — el proceso de hipermutación somática y selección que opera en los centros germinales — incrementa progresivamente la afinidad de unión de los anticuerpos IgG hacia los epítopos del RABV (Tizard, 2021; Day, 2007). El resultado es una población de células plasmáticas de larga vida que secretan IgG anti-RABV de alta afinidad, constituyendo el isotipo de anticuerpo dominante medido por RFFIT y FAVN en el momento de la toma de muestra regulatoria (≥ 30 días post-primovacunación).

2.3. Cinética Temporal del Desarrollo de Anticuerpos Post-Vacunación

La literatura científica documenta la cinética de anticuerpos post-vacunación en perros tanto en modelos experimentales de desafío como en grandes estudios de seroprevalencia de campo, a partir de los cuales se sintetiza la siguiente descripción general. Es importante señalar que la evidencia publicada refleja tendencias a nivel poblacional y una variabilidad individual sustancial; los intervalos descritos a continuación son rangos observados en distintos estudios, no constantes fisiológicas fijas.

Wallace et al. (2017), en el análisis publicado de mayor escala sobre resultados de primovacunación antirrábica en perros (n = 8.011), documentaron que el fracaso en alcanzar ≥ 0,5 UI/mL se asoció, entre otros factores, con intervalos más cortos entre la vacunación y la toma de muestra. El estudio demostró que la relación entre el tiempo post-vacunación y la adecuación serológica no es lineal y está fuertemente modulada por la edad, el tamaño corporal y el número de dosis previas recibidas.

Es pertinente señalar que la literatura publicada no respalda un único "día pico" de respuesta de anticuerpos a la primovacunación que sea universal para todos los perros, todas las vacunas y todas las condiciones. Diversos estudios han observado seroconversión inicial en una fracción de los perros dentro de la primera semana, mientras que otros documentan que una proporción significativa de animales no alcanza ≥ 0,5 UI/mL hasta la tercera o cuarta semana post-vacunación. Esta heterogeneidad biológica es precisamente la razón que sustenta el requisito regulatorio de un intervalo mínimo de ≥ 30 días antes de la toma de muestra, tal como se describe en el Volumen I de esta serie.

2.4. Memoria Inmunológica Tras la Primovacunación

Un resultado inmunológico central de la primovacunación exitosa es la generación de memoria inmunológica: poblaciones de linfocitos B de memoria de larga vida y linfocitos T CD4+ y CD8+ de memoria que persisten en los órganos linfoides secundarios y en la circulación periférica durante meses o años tras la vacunación (Day, 2007; Tizard, 2021). Ante una reexposición al antígeno del RABV — ya sea mediante una vacunación de recuerdo o una exposición natural — estas células de memoria montan una respuesta secundaria cualitativamente y cuantitativamente superior: menor fase lag, producción de anticuerpos más rápida, títulos pico más elevados y mayor afinidad de los anticuerpos IgG.

Esta distinción entre la respuesta primaria y la secundaria tiene significación operativa directa para el movimiento internacional de mascotas: los animales que reciben una vacunación de recuerdo válida dentro del período de cobertura de una dosis previa no requieren esperar 30 días post-vacunación antes de la toma de muestra serológica regulatoria, dado que la memoria preexistente garantiza una restauración rápida y robusta de anticuerpos. Los marcos regulatorios, incluido el Reglamento (UE) n.° 576/2013 y las disposiciones del CDC, distinguen explícitamente estos dos escenarios.

3. El Umbral ≥ 0,5 UI/mL: Fundamento Técnico y Limitaciones Interpretativas

3.1. Origen y Fundamento Científico

El umbral de ≥ 0,5 Unidades Internacionales por mililitro como criterio regulatorio de inmunidad antirrábica adecuada no derivó de un único estudio pionero, sino que emergió de la acumulación progresiva de datos provenientes de experimentos de desafío, evaluaciones de eficacia vacunal y trabajos de estandarización de métodos de seroneutralización realizados durante las últimas décadas del siglo XX (Moore & Hanlon, 2010; Briggs et al., 1998).

Moore & Hanlon (2010), en un análisis exhaustivo de los anticuerpos anti-rábicos como sustitutos de protección, revisaron la base de evidencia del criterio de 0,5 UI/mL y concluyeron que, a nivel poblacional, los animales con títulos séricos en o por encima de este umbral presentan un riesgo sustancialmente menor de desarrollar rabia clínica tras el desafío experimental. El umbral fue adoptado por la OMS y la Oficina Internacional de Epizootias (hoy WOAH) y formalizado en el Código Sanitario para los Animales Terrestres de la WOAH como el correlato internacionalmente reconocido de respuesta adecuada a la vacunación antirrábica.

Un matiz interpretativo crítico documentado en la literatura es que ≥ 0,5 UI/mL constituye un correlato operacional de protección a nivel poblacional — no una garantía binaria de inmunidad esterilizante en cada animal individual que supera el umbral (Moore & Hanlon, 2010). Los animales por debajo del umbral no están necesariamente desprotegidos (la inmunidad celular puede contribuir a la resistencia), y los animales por encima del umbral no tienen garantía absoluta de sobrevivir cualquier escenario potencial de exposición. El umbral es un criterio de decisión regulatoria, seleccionado por su utilidad práctica y reproducibilidad, no como marcador de certeza biológica.

3.2. La Unidad UI/mL: Calibración y Estandarización

Los resultados de RFFIT y FAVN se expresan en Unidades Internacionales por mililitro (UI/mL), estandarizados frente a un suero de referencia OMS/WOAH de título definido (actualmente el suero de referencia OMS 2.ª norma, 30 UI/mL). Esta estandarización — descrita en el Manual de Pruebas de Diagnóstico y Vacunas para Animales Terrestres de la WOAH (2024) y operacionalizada a través del sistema de laboratorios aprobados con acreditación ISO 17025 — permite comparar resultados de diferentes laboratorios y ubicaciones geográficas en una escala común. El programa anual de ensayos de competencia coordinado por el ANSES-EURL (Wasniewski et al., 2019) es el mecanismo principal por el cual se verifica y mantiene internacionalmente la comparabilidad del punto de decisión ≥ 0,5 UI/mL.

4. Fundamentos Metodológicos de la Prueba de Inhibición de Focos Fluorescentes Rápida (RFFIT)

4.1. Principio y Protocolo Técnico

La Prueba de Inhibición de Focos Fluorescentes Rápida fue desarrollada por Smith, Yager y Baer (1973) como una adaptación en microtécnica de la prueba de neutralización en ratón original, reemplazando la inoculación in vivo en ratón por metodología de cultivo celular in vitro. La RFFIT es el método de referencia de la OMS y del ACIP para la serología antirrábica humana y es ampliamente utilizada en laboratorios aprobados para la certificación de animales de compañía (Moore & Hanlon, 2010; Moore, 2018).

El principio de la RFFIT se basa en la capacidad de los anticuerpos del suero problema para neutralizar una dosis fija del virus de desafío estándar (CVS-11 o equivalente) e impedir así la infección de una monocapa de células susceptibles (típicamente células de neuroblastoma de ratón, MNA). El procedimiento comprende:

1. Dilución seriada del suero problema y del estándar de referencia en microplacas.
2. Adición de un título fijo del virus de desafío CVS a cada pocillo.
3. Incubación para permitir la unión anticuerpo-virus (neutralización).
4. Adición de células susceptibles e incubación adicional.
5. Fijación y tinción con anticuerpo anti-nucleoproteína del RABV conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC).
6. Microscopía de fluorescencia para recuento de focos infectados (células fluorescentes).
7. Cálculo del título de anticuerpos (UI/mL) frente al suero de referencia mediante el método de Reed–Muench o Kärber.

Dado que la RFFIT requiere el uso de RABV vivo, debe realizarse en un laboratorio con infraestructura de bioseguridad adecuada (mínimo BSL-2, BSL-3 en muchas jurisdicciones) por personal capacitado en la técnica. El requisito de virus infeccioso y equipamiento especializado restringe la RFFIT a laboratorios de referencia y aprobados designados (Moore, 2018; Wasniewski et al., 2019).

4.2. Consideraciones Analíticas y Limitaciones Conocidas

Los parámetros técnicos que afectan el desempeño de la RFFIT incluyen: el lote y el título del virus de desafío CVS; la concentración y el número de pasaje de la línea celular; la temperatura de incubación y la concentración de CO₂; la elección del conjugado FITC; y el método de lectura visual o automatizado de fluorescencia (Moore, 2018). La estandarización de estas variables entre laboratorios es uno de los objetivos principales del programa anual de ensayos de competencia del ANSES-EURL (Wasniewski et al., 2019). Briggs et al. (1998) documentaron que la variación prueba-a-prueba (intralaboratorio) es más pronunciada para sueros con títulos en el rango bajo a moderado, específicamente para títulos RFFIT por debajo de 1,0 UI/mL — un rango que incluye el umbral regulatorio de 0,5 UI/mL y convierte la repetición de las muestras límite en una práctica de calidad prudente.

5. Fundamentos Metodológicos de la Prueba de Neutralización Viral por Anticuerpos Fluorescentes (FAVN)

5.1. Desarrollo y Principio

La Prueba de Neutralización Viral por Anticuerpos Fluorescentes fue desarrollada y descrita por Cliquet, Aubert y Sagné (1998) en el CNEVA Nancy (actualmente Laboratorio de ANSES Nancy para la Rabia y la Vida Silvestre — el EURL). La prueba FAVN es una microadaptación de la RFFIT, diseñada para un procesamiento de mayor rendimiento, y se ha convertido en el método predominante en los laboratorios europeos aprobados para la serología de exportación de animales de compañía.

El principio técnico de la FAVN es funcionalmente equivalente al de la RFFIT: dilución seriada del suero problema; adición de una dosis fija del virus de desafío CVS; incubación en cultivo celular; fijación y tinción con FITC; microscopía de fluorescencia; cálculo de título mediante Reed–Muench (Cliquet et al., 1998). Las diferencias técnicas clave incluyen el formato de placa (microplacas de 96 pocillos optimizadas para FAVN), el tipo celular (frecuentemente células BHK-21 en el protocolo original de FAVN frente a células MNA en la RFFIT estándar) y parámetros menores de incubación (Cliquet et al., 1998; Wasniewski et al., 2019).

5.2. Equivalencia Reconocida con RFFIT

El artículo de desarrollo original (Cliquet et al., 1998) demostró una especificidad del 100% utilizando 414 sueros de zonas libres de rabia y una precisión satisfactoria frente a sueros de título conocido, con resultados concordantes entre FAVN, RFFIT y la prueba de neutralización en ratón para los paneles de sueros comparativos. El Manual Terrestre de la WOAH (2024) reconoce formalmente que FAVN y RFFIT producen resultados equivalentes para los fines de la certificación regulatoria, lo que sustenta su intercambiabilidad en las redes de laboratorios aprobados a nivel mundial.

Briggs et al. (1998) confirmaron explícitamente esta equivalencia en un estudio comparativo con 168 sueros de animales no vacunados y 70 sueros de perros y gatos vacunados con títulos elevados: no se observaron diferencias significativas en sensibilidad ni especificidad entre RFFIT y FAVN para los animales no vacunados ni para los vacunados de título alto. Para el subconjunto de 95 sueros con títulos bajos a moderados por RFFIT (< 1,0 UI/mL), se documentó variación prueba-a-prueba en ambos métodos por igual, sin dirección estadísticamente significativa de discordancia que favoreciera ninguno de los dos ensayos.

5.3. Variabilidad Interlaboratorio y Aseguramiento de Calidad

La variabilidad interlaboratorio en la cuantificación de rVNA es un desafío documentado y activamente gestionado en las redes de serología antirrábica. Wasniewski et al. (2019), al reportar el programa anual de ensayos de competencia del ANSES-EURL (el laboratorio coordinador designado por la UE para los laboratorios aprobados de serología antirrábica en virtud de la Decisión de la Comisión 2000/258/CE), describieron un diseño de ensayo de competencia (PT) conforme a los estándares internacionales ISO 13528 e ISO/IEC 17043. El programa distribuye paneles de sueros estandarizados a los laboratorios aprobados participantes anualmente, y los resultados se evalúan frente a valores asignados calculados a partir de datos históricos acumulados del PT. Este marco de calidad continuo es el mecanismo principal que garantiza que un resultado en UI/mL de un laboratorio en Perú, Europa o Asia sea comparable e intercambiable legalmente para los fines de la certificación regulatoria.

6. Factores que Modulan la Respuesta de Anticuerpos Post-Vacunación

La literatura científica identifica múltiples variables del huésped y del producto que influyen en la magnitud y el momento de la respuesta rVNA post-vacunación en perros. Estos factores explican por qué los resultados de la primovacunación no son uniformes entre animales y por qué los datos serológicos a nivel poblacional siempre reflejan una distribución — no un resultado único — de respuestas de anticuerpos.

7. Fallo Vacunal Primario y No Respondedores

7.1. Definición y Existencia Documentada

La literatura de inmunología veterinaria reconoce dos formas principales de fracaso de la vacunación:

El fallo vacunal primario hace referencia a la incapacidad de un animal para generar una respuesta de anticuerpos detectable y adecuada tras una vacunación correctamente administrada. Esto contrasta con el fallo vacunal secundario (declive de la inmunidad tras una respuesta previa adecuada) y el fallo vacunal aparente (fracaso atribuible a almacenamiento incorrecto de la vacuna, error de administración o toma de muestra en un momento inmunológicamente inadecuado).

Wallace et al. (2017) señalaron explícitamente que los estudios publicados en distintas poblaciones y contextos han reportado que aproximadamente el 10% de los perros inmunológicamente naive pueden no alcanzar ≥ 0,5 UI/mL tras una única dosis de vacuna antirrábica, con una proporción que varía sustancialmente según la edad, la raza, el producto vacunal y el intervalo entre vacunación y toma de muestra. Este dato no debe interpretarse como una constante universal: la literatura refleja una heterogeneidad genuina, y las tasas reportadas dependen de manera crítica del diseño del estudio, las características poblacionales y el momento en que se realizó la serología.

7.2. Factores Asociados al Fallo Vacunal Primario

Kennedy et al. (2007), en un conjunto de datos de más de 10.483 perros, identificaron asociaciones estadísticamente significativas entre el fallo a la primovacunación y los siguientes factores: edad menor de un año; tamaño corporal grande; productos vacunales específicos (con variación significativa entre marcas en la misma cohorte); y número de dosis recibidas. Berndtsson et al. (2011) confirmaron en una cohorte prospectiva sueca (n = 6.789) que los protocolos de vacunación de dos dosis reducían significativamente la proporción de perros que no alcanzaban ≥ 0,5 UI/mL en comparación con los protocolos de dosis única, especialmente en razas grandes.

Estos hallazgos tienen implicaciones prácticas para los perros que se someten a serología para exportación internacional: los animales con factores de riesgo de fallo vacunal primario (jóvenes, razas grandes, protocolo de dosis única) pueden beneficiarse de la identificación temprana del fallo potencial mediante una programación adecuada, y de anticipar la posibilidad de un ciclo de revacunación si el resultado inicial es inadecuado.

7.3. Enfoque Técnico Recomendado ante Títulos < 0,5 UI/mL

Cuando un resultado de serología regulatoria cae por debajo de ≥ 0,5 UI/mL, el consenso publicado y los principales marcos regulatorios (UE, CDC, WOAH) indican la siguiente secuencia: el animal requiere revacunación (con una dosis de refuerzo), seguida de un nuevo evento de toma de muestra. Bajo las disposiciones de la UE (Reglamento 576/2013), un resultado de título fallido requiere el reinicio completo del intervalo de 30 días post-vacunación más el período de espera de 3 meses previo al movimiento a partir de la nueva fecha de toma de muestra. Bajo las disposiciones del CDC, se requiere la revacunación y una nueva muestra obtenida ≥ 30 días después de la nueva vacunación para que el animal sea elegible para la importación sin un período de cuarentena de 28 días.

8. Limitaciones del Presente Documento

• Este documento es una revisión descriptiva sin metodología meta-analítica. La selección de citas fue intencional, no sistemática, con el objetivo de representar la base de evidencia mejor respaldada para los conceptos descritos.
• La cinética inmunológica descrita en la Sección 2 se deriva de estudios realizados predominantemente en poblaciones de perros europeas y norteamericanas bajo condiciones de estudio específicas. La generalización a todas las poblaciones geográficas, entornos de enfermedades tropicales y composiciones de razas locales (incluidas las prevalentes en Perú) debe aplicarse con la debida cautela.
• Los textos regulatorios citados en este documento reflejan el estado de las disposiciones aplicables a principios de 2026. Las normativas de movimiento internacional de mascotas están sujetas a actualización; los profesionales deben verificar los requisitos actuales con la autoridad competente pertinente antes de iniciar protocolos de exportación.
• Este documento no aborda en detalle la serología antirrábica en gatos o hurones; si bien los principios inmunológicos son en líneas generales similares, aplican consideraciones específicas de especie y los lectores deben consultar la literatura específica y las fichas técnicas (SmPC) correspondientes.
• No se realiza ninguna recomendación clínica a nivel del animal individual. Todas las decisiones clínicas deben ser tomadas por un médico veterinario colegiado con acceso al historial, el estado de salud y los requisitos regulatorios aplicables del animal específico.

9. Declaración de Alcance

Referencias

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